داروی انتخابی برای درمان تجربی عفونت ادراری بدون علامت در زنان در طول چندین سال گذشته بوده است. با این حال مقاومت به این ترکیب بیشتر از 20 % در بسیاری از کشور ها است. در ایالات متحده آمریکا، مقاومت در برابر کوتریموکسازول از 15% در سال 1998 به 3/21 % در سال 2003 تا 2009 افزایش یافته است. آنتی بیوتیک های بتا لاکتام به طور گسترده در درمان UTI استفاده می شود. در بین آنها، آمپی سیلین یا آموکسی سیلین را به عنوان داروی خط اول که منجر به افزایش سطوح مقاومت می شوند، توصیه نمی شود. با درمان التهاب مثانه بدون علامت برای طولانی مدت ، مقاومت به آمپی سیلین در طول سال افزایش یافته است. آموکسی سیلین به علاوه کلاولانیک اسید یک سطح بالایی از فعالیت را به نسبت آمپی سیلین نشان می دهد. دیگر بتالاکتام های خوراکی مثل سفوروکسیم ( 9/8 % مقاومت ) یا سفیکسیم (9/6 % مقاومت ) فعالیت های خوبی را در برابر ایزوله های اشریشیا کلی ادراری نشان می دهند. اما مقاومت به هر دو دارو در بیماران مسن بالاتر بوده است. فلوروکینولون می تواند گزینه ای برای درمان UTI باشد.
در مطالعه ای ، مقاومت به سیپروفلوکسازین در 9/23 % از نمونه های UPEC پیدا شده است. در این مطالعه ، مقاومت به سیپروفلوکسازین در UPEC درمان شده در عفونت های ادراری پیچیده( 5/19 ) بیشتر از UPEC های بدون عارضه است (5/ 8 %). در مطالعات انجام شده ، بیماران مسن تر سطوح بالایی از مقاومت را به فلوروکینولون نشان می دهند. نیتروفورانتوئین یک فعالیت خوب را در برابر نمونه های جدا شده UPEC با تنها 8/3 % جدا شده های مقاومت نشان داده است. اگرچه ، مقدار دوز تجویزی دارو و پتانسیل سمیت ریوی سودمندی آن را کاهش می دهد. فسفومایسین به عنوان فعال ترین آنتی بیوتیک خوراکی در مقابل ایزوله های UPEC باقی مانده است. مقاومت به این دارو 7/1 % در مطالعات چند مرکزی منتشر شده است. توسط Andreu بوده است و این ترکیب معمولا فعالیت خود را در برابر تولید کننده های ESBL حفظ می کند( Sotto et al. 2007).
2-4-3- بررسی ارتباط بین تشکیلبیوفیلم، فاکتورهاییوروویرولان ومقاومت ضدمیکروبی
تشکیل بیوفیلم ممکن است به عنوان یک عامل تعیین کننده بیماری زای دیگر که اجازه می دهد سویه های باکتری برای مدت طولانی تر در دستگاه ادراری_ تناسلی باقی بمانند و نفوذ کنند، در نظر گرفته شود. بیوفیلم امتیازات مختلفی را به باکتری می بخشد، از جمله کسب تحمل به آنتی بیوتیک، بیان چندین فاکتور ویرولان، افزایش مقاومت در برابر فاگوسیتوز و سایر مکانیسم های دفاعی میزبان (Soto et al. 2007) .
در فرایند بالینی، تشکیل بیوفیلم عامل اصلی خصوصیت تداوم عفونت، علی رغم درمان با آنتی بیوتیک و نیروهای هیدرودینامیکی است. UTI حاد ایجاد شده توسطUPEC می تواند منجر به عفونت مجدد شود که ” عود” نامیده می گردد یعنی زمانی که توسط همان سویه به عنوان سویه درگیر در UTI اصلی یا به عنوان عفونت مجدد وقتی که UTI با سویه های دیگر ایجاد می شود. در زنان با UTI عودکننده یا راجعه نشان داده شده است که 74% سویه های عود کننده ، تشکیل دهندگان بیوفیلم بودند. با این حال تشکیل بیوفیلم ممکن است کلید تعیین کننده ای برای حضور UPEC در مخزن واژن یا سلول های اپیتلیومی مثانه یا هر دو باشد.
محققین پیشنهاد کردند که مهار اتصال باکتری به سطح یورواپیتلیومی ، تعاملات بین مولکول های اتصالی باکتریایی به نام ادهسین ها و گیرنده های دستگاه ادراری کونژوگه با آنها ، می تواند برای جلوگیری از تشکیل بیوفیلم ها جالب توجه باشد. مطالعات در زمینه مقایسه سویه های UPEC بیوفیلم مثبت در مقابل سویه های بیوفیلم منفی نشان داده است که درصد مقاومت به نالیدلیک اسید در میان آنهایی که بیوفیلم تشکیل نمی دهند نسبت به تشکیل دهندگان بیوفیلم، بالاتر بوده است.
( Costerton et al .1999; Hanna et al. 2003 & Soto et al. 2007).

2-5- نقش آب گریزی (Hydrophobicity) در اتصال باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن
اتصال باکتریایی بوسیله واکنش های اختصاصی ( رسپتور لیگاند مانند) و غیر اختصاصی اداره می شود، تمام این نیروی واکنش ها به ویژگی های فیزیکو شیمیایی زیرلایه و سطوح باکتریایی، مانند آبگریزی (Hydrophobicity) وابسته است. واکنش های هیدروفوبیک نقشی را در اتصال میکروارگانیسم ها به طیف وسیعی از سطوح ایفا می کند و تشکیل بیوفیلم را که منجر به اتصال باکتریایی می شود را تسهیل می کند. به خوبی ثابت شده است که بیوفیلم های باکتریایی در مقایسه با همتایان پلانکتونی خود به درمان آنتی بیوتیکی بسیار مقاوم هستند(Tahmourespour et al. 2008; Rosenberg et al. 1986).
ماهیت هیدروفوبیک خارجی ترین سطح باکتریایی به عنوان یک فاکتور در پارتیشن بندی میکروارگانیسم ها، در اتصال باکتری ها به سطوح پلاستیکی، در اتصال باکتری ها به فاگوسیت ها و دیگر سلول های پستانداران و در رشد سلول ها بر روی لایه های نامحلول آبگریز مثل هیدروکربن ها،ذکر شده است( Rosenberg et al. 1980).
Rosenberg در سال 1981، یک روش ساده برای شناسایی اولیه سریع کلونی های سلول های هیدروفوبیک شرح داده است. این تکنیک بر اساس اتصال سلول های مختلف به سطح پلی استرن است. اتصال تعدادی از گونه های باکتریایی به پلی استرن توسط دانشمندان دیگر مورد بررسی قرار گرفته است و به واکنش های هیدروفوبیک بین سلول ها و سطوح پلاستیکی نسبت داده شده است. در آزمایش های اولیه نشان دادند که ارتباط مستقیمی بین سویه های باکتریایی که میل ترکیبی بالایی را برای هیدروکربن های مایع و توانایی این سویهها به اتصال به پلی استرن ازخودنشان می دهند، وجود دارد( Rosenberg et al. 1981).
به طور مشابه، سویه های باکتریایی که به هیدروکربن ها متصل نمی شوند به راحتی می توانند از سطح پلی استرن با شستن جا به جا شوند.
اهمیت آب گریزی (Hydrophobicity) سطح سلول به عنوان یک فاکتور بیماریزا ( که اتصال باکتریایی را به سلول های پستانداران تسهیل می کند.) نزدیک به یک قرن است که شناخته شده است. این یک عامل مهم در کمک به باکتری اشریشیا کلی به اتصال به سطوح مختلف برای کلونیزاسیون است. باکتری ها بوسیله سرم نرمال ناشی از فعالیت سیستم کمپلمان ، لیز می شوند. مسیر متناوب فعال کمکی، به طور بالقوه مهم تر از مسیر کلاسیک است. مقاومت باکتریایی به از بین بردن توسط سرم به اثرات انفرادی یا ترکیبی، پلی ساکارید های کپسولی ، لیپوپلی ساکاریدها و پروتئین های سطحی منجر میشود.
( Cerca et al . 2005; Bruinsma et al. 2001)

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منبع تحقیق با موضوع شهر تهران، صنعت فرهنگ

3-1- مواد و وسایل:
3-1-1- محیط های کشت استفاده شده
محیط کشت ائوزین متیلن بلو(EMB agar)
محیط کشت نوترینت آگار (Notriannt agar)
محیط کشت مولر هینتون آگار (MHA)
محیط کشت Brain Heart Infiusion (BHI)
محیط کشت لوریا برتانی براث(LB broth)
محیط کشت افتراقی انتروباکتریاسه
از شرکت Merckآلمان تهیه گردید.
3-1-2- دیسک های آنتی بیوتیک و مواد شیمیایی
دیسکهای آنتی بیوتیکی استفاده شده برای بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی شامل، آمپی سیلین (AM(10µg، آمیکاسین g)µAN(30 ، کوتریموکسازول SXT(1.25/23.75µg) ،جنتامایسین GM(10µg) ، سیپروفلوکسازین CP(5µg) و نیتروفورانتوئین FM(10µg) از شرکت پادتن طب تهران خریداری شد.
گلیسرول (شرکت Merck آلمان)
هیدروکربن n_octane (شرکتMerck آلمان )
اسید استیک گلاسیال (شرکت Merck آلمان)
کریستال ویوله (شرکت Merck آلمان)
محلول های رنگ آمیزی گرم (شرکت Merck آلمان)
3-1-3- کیت ها
کیت استخراج DNA تهیه شده از شرکت سیناژن با شماره DN8115C
کیت PCR تهیه شده از شرکت سیناژن
3-1-4- دستگاه ها
ورتکس مدل IKA VORTEX- Genius 3
میکروفیوژ مارک Eppendorf
سانتریفیوژ مارک Hettich Zentrifuge
انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین
اسپکتوفتومتر Jenwey 6305 UV/Vis
الکتروفورز مدل Major Sceince
ترانس ایلومیناتور مارک Gel Vue
ژل داکیومنتیشن مارک Uvi Pro- Uvi Tec
دستگاه ترمو سایکلر مدل Corbett research ساخت کشور استرالیا
سمپلر ثابت و متغیر مدل Transferpette
ELYSA Reader
میکروتیوب 1.5 cc و 0.2 ساخت شرکت Eppendof
نوک سمپلر زرد ، آبی و کریستالی ساخت شرکت Extra gene
میکروتیتر پلیت 96 خانه
3-2- جمع آوری نمونه ها
در این بررسی ، طی مدت 3 ماه ( از بهمن ماه سال 1390 تا فروردین ماه سال 1391) تعداد 100 نمونه از کشت باکتری بیماران مشکوک به عفونت دستگاه ادراری (UTI) از بیمارستان های سطح استان سمنان جمع آوری شد و به آزمایشگاه میکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی دامغان ارسال گردید.
3-3- جداسازی و خالص سازی
در این مطالعه تعداد 100 نمونه ادراری از افراد مبتلا به عفونت مجاری ادراری جمع آوری گردید، سپس به منظور جداسازی اشرشیا کلی و اطمینان از خالص بودن نمونه ها، هر کدام از نمونه ها به طور مجزا ابتدا بر روی محیط کشت EMB آگار و سپس بر روی کشت نوترینت آگار کشت داده شدند و با تست های بیوشیمیایی متداول شامل بررسی استفاده از سیترات به عنوان تنها منبع کربن با استفاده از محیط سیمون سیترات آگار (SCA)، بررسی تولید CO2 در محیط سه قندی حاوی آهن (TSI) ، بررسی حرکت، اندول و سولفور در محیط SIM ، بررسی کلنی با جلای فلزی بر روی محیط ائوزین متیلن بلو (EMB) حضور باکتری اشرشیا کلی تایید شد. پس از انجام این کار مشخص گردید که 70 نمونه حاوی باکتری اشرشیا کلی می باشد. سویه های تایید شده اشریشیا کلی با روش گلیسرول استوک برای ذخیره سازی ( در فریزر منهای 20 درجه سانتیگراد ) نگهداری شد، تا در آزمایشات دیگر مورد استفاده قرار گیرند.
3-4- مشاهده میکروسکوپی
جهت مشاهده باکتری اشریشیا کلی در زیر میکروسکوپ نوری و تطبیق مورفولوژی آنها با خصوصیات ذکر شده در مورد آن میکروارگانیسم می توان از کلنی های رشد یافته باکتری بر روی محیط کشت نوترینت آگار یک لوپ برداشته و بر روی لام تمیز حاوی یک قطره سرم فیزیولوژی استریل منتقل کرد، پس از تثبیت کردن با استفاده از رنگ آمیزی گرم لام ها رنگ آمیزی شد. با انتقال لام ها به زیر میکروسکوپ ومشاهده با عدسی 100، باسیل های گرم منفی به رنگ صورتی یا قرمز روشن مشاهده شد.
3-5- بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC
برای انجام آزمایش از روش دیسک پلیت Kirby – Bauer استفاده شد (Bauer.1966). ابتدا کشت تازه 24 ساعته از باکتری در محیط کشت نوترینت آگار تهیه و سپس از کلنی های ظاهر شده بر سطح محیط کشت سوسپانسیونی معادل استاندارد نیم مک فارلند (1 cfu ml- 108 ? 5/1 ) تهیه شد. سپس با کمک سوآپ استریل از هر باکتری برروی محیطMHA بصورت متراکم کشت داده شد. پس از 5 دقیقه که رطوبت ناشی از سوسپانسیون باکتریها جذب محیط شد، دیسک های آنتی بیوتیک مورد نظر برای هر باکتری به کمک پنس استریل با رعایت فاصله هر دیسک از دیگری و نسبت به لبه پلیت بر روی محیط MHA قرار داده شد. پلیت های حاوی باکتری به مدت 24 ساعت در ?37 گرماگذاری شدند.
پس از این مدت هاله های عدم رشد اندازه گیری و با جدول استاندارد آنتی بیوتیک ها بررسی شدند (National Committee For Clinical Laboratory Standards.2005).
3-6- بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت
بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت با استفاده از روش اتصال

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید