پایان نامه با واژگان کلیدی
باکتری، میکروتیوب، میکرولیتر، حاوی پایان نامه ها و مقالات

توالیT7•Tag codingدرN ترمینال و توالی His•Tag codingدر C ترمینال ( این قسمت برای غربالگری آنزیم بیان شده با استفاده از ستون نیکل سفاروز لازم است)، منشا همانند سازی pBR322 و f1 ، ژن مقاوم به کانامایسین، پروموتر وترمیناتور T7 ، جایگاه های برش برای آنزیمهای محدودگر مختلف، این آنزیمها هر کدام دارای یک جایگاه برش بر روی ژن هستند، توالی کد کننده LacI هم در این وکتور وجود دارد. وکتور (+) pET28-a برای اهداف مختلفی از جمله کلونینگ DNA، تعیین توالی DNA ، بیان ژن و … طراحی شده است.

الف

ب
شکل3-1 ) ناقل کلونینگ PET 28a ، ا لف) ساختار ژنتیکی، ب ) منطقه کلونینگ/ بیان ناقل PET 28a

3-7-2 آماده سازی قطعه DNA برای انتقال به درون وکتور
بعد از انجام مراحل PCR و به دست آوردن غلظت مناسبی از ژن مورد نظر تمام محصولات روی ژل آگارز برده شد، اگر باند حاصل شارپ باشد و محصول PCR بر روی ژل فاقد باند غیر اختصاصی باشد، این DNA برای انجام کلونینگ برده می شود. اگر بر روی ژل باند غیر اختصاصی مشاهده شود یا همراه باند اصلی، اسمیر هم باشد باید باند اصلی را از روی ژل استخراج گردد.

3-7-3 استخراج DNA از روی ژل
ابتدا ژل 1 درصد آگاروز تهیه شده و با متصل کردن دندانه های شانه، ژلی با چاهک های بزرگتر تهیه گردید. بدین ترتیب کل محصول PCR درون چاهک ها خالی شده و الکتروفورز انجام گرفت. بعد از اتمام الکتروفورز باند مورد نظر در زیر لامپ UV وبا کمک یک تیغ سترون شده بریده شده و داخل ویالی که قبلا توزین گردیده بود، ریخته شد و سپس بر اساس protocol کیت استخراج DNA (Fermentas KO531) خالص سازی گردید.

3-7-4مراحل کلون مجدد
الف- هضم آنزیمی
از آنجا که پرایمرهای طراحی شده دارای جایگاه برش آنزیم های محدودگرNde1وXho1می باشد، جهت کلون مجدد، در ابتدا دو واکنش هضم آنزیمی به ترتیب با Nde1 وXho1 به مدت 5 ساعت بطور همزمان بر روی محصول PCRو پلاسمید pET28-aانجام شد. در اینجا از بافر Oاستفاده گردید. ترکیب واکنش هضم آنزیمی در حجم 20 میکرولیتر به صورت زیر می باشد:
10µl D W; 2µl 10X buffer; 2µl restriction enzyme; 6 µl PCR product /pET28-a
لازم به ذکر است که پس از هر واکنش آنزیمی تخلیص محصول واکنش با کیت PCR product Clean up انجام می شد.
ب- واکنش الحاق
واکنش الحاق محصول PCRو پلاسمید هضم شده انجام شد. واکنش الحاق شامل ترکیبات زیر و در حجم20 میکرولیتر با نسبت های بیان شده می باشد:

جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق
10X buffer (μl)
T4 DNA ligase (μl)
Digested insert (μl)
Digested pET28-a (μl)
DW (μl)
Pmol plasmid: pmol DNA
2
2
2
1
1
1
6
6
10
6
2
2
5
9
5
1:1
1:3
1:5

مخلوط الحاق در C˚16 به مدت 16 ساعت انکوبه شد.

ج-انتقال DNA (ترانسفورماسیون)
پس از انجام واکنش الحاق و تخلیص محصول واکنش با کیت Cleanup، انتقال با روش شیمیایی در میزبان E.coliDH5α طی مراحل زیر انجام شد.

3-7-5 مستعد کردن باکتری DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0)
باکتری مستعد، باکتری است که توانایی ترانسفورم شدن با یک قطعه DNA خارجی را داشته باشد. برخی باکتریها در مرحله رشد لگاریتمی و فاز ثابت، به طور خود به خود مستعد دریافت ژن می شوند اما باکتری (اشریشیا کولی) DH5α طی مراحل زیر به طور مصنوعی تبدیل به سلولی مستعد دریافت DNA میگردد:
1- یک کلونی باکتری از پلیت LB درmL 5 محیط LB مایع کشت و به مدت یک شب در دمای C˚37انکوبه گردید.
2- روز بعد μl 100 از این محیط کشت در mL 5 محیط کشت جدید تلقیح و تا رسیدن جذب نوری آن در طول موج 600 نانومتر به 3/0 الی 5/0 درC˚37 انکوبه شد.
3- فالکون مورد نظر به مدت 5 دقیقه درrpm 6000 و دمای C˚4 سانتریفیوژ شد.
4- محلول رویی دور ریخته شد و سپس رسوب به آرامی در600 میکرولیتر کلرید کلسیم 100 میلی مولار سرد حل گردید. پس از آن تیوب به مدت 45 دقیقه درون یخ قرار داده شد. در پایان 45 دقیقه، سانتریفیوژ با شرایط قبلی انجام گرفت.
5- محلول رویی سانتریفوژ دور ریخته شده، رسوب در 200 میکرولیتر کلرید کلسیم سرد حل گردید. این 200 میکرولیتر به 4 میکروتیوب، هرکدام 50 میکرولیتر، تقسیم شد. 2 میکروتیوب مخصوص واکنش تست، 1 میکروتیوب مخصوص کنترل منفی و 1 میکروتیوب نیز مخصوص کنترل مثبت انتقال.

3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتری مستعد DH5α
1- به باکتریهای مستعد در 2 میکروتیوب تست، مقدار10 تا 15 میکرولیتر محصول الحاق، به میکروتیوب کنترل مثبت نیز pET28-a هضم نشده افزوده شد، و به میکروتیوب کنترل منفی هیچ نوع مولکول DNA ای اضافه نگردید. لازم به ذکر است که مقدار باکتری های مستعد در هر میکروتیوب 150 میکرولیتر است.
2- میکروتیوبها به مدت 30 دقیقه درون یخ قرار داده شدند.
3- سپس به مدت 5 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند.
4- مجدداً میکروتیوب ها به مدت 2 دقیقه درون یخ قرار داده شدند.
5- 800 میکرولیتر از محیط کشت LB بدون آنتی بیوتیک به هرکدام از میکروتیوب ها اضافه و به مدت یک ساعت درC˚37 انکوبه گردیدند.
6- پلیت های LB آگار حاوی آنتی بیوتیک به مدت 30 دقیقه قبل از استفاده در دمای C˚37 انکوبه شدند.
7- محتوای میکروتیوب ها به مدت 3 دقیقه درrpm5000 سانتریفیوژ شده، محلول رویی به شکلی دور ریخته شد که 30 میکرولیتر از محیط کشت به همراه توده باکتریایی باقی ماند.
8- توده باکتری باقی مانده به اضافه مایع رویی خوب پیپتاژ شد و بر روی سطح LB آگار واجد آنتی بیوتیک کانامایسین پخش گردید.
9- در نهایت پلیت ها در C˚37 به مدت 16-18 ساعت انکوبه شد.
بعد از این مدت اگر انتقال پلاسمید
نوترکیب به درون باکتری با موفقیت انجام شده باشد، کلونی های مقاوم به آنتی بیوتیک (کانامایسین) روی پلیت دیده می شوند.
د) تعیین پلاسمیدهای نوترکیب
برای تأیید کلونی‌های حاوی ژن نوترکیب از روش Cracking استفاده شد. در این روش ابتدا پلیت های مادر LB آگارحاوی کانامایسین تهیه و هر یک به 22 قسمت تقسیم شد، سپس همه کلونی های بدست آمده بر روی این پلیت ها کشت داده شد و در دمای C˚37 به مدت 12 ساعت انکوبه شد. پس از رشد کلونی ها، از روش Cracking به صورت زیر استفاده شد:

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   مقاله با موضوعسابقه خدمت، پرسش نامه، سطح معنادار، مقدار خطا

3-8 بافر Cracking
EDTA 5 mM; NaOH 50 mM، SDS 0.5%

روش کار:
از بافر Cracking به مقدار 20 میکرولیتر داخل میکروتیوب ها ریخته شد. سپس کلونی ها به مقدار مناسب (به اندازه سر لوپ) در بافر مذکور معلق شد.
میکروتیوب ها به مدت 30 دقیقه در دمای C˚ 55 انکوبه شد.
پس از انکوباسیون، میکروتیوبهای حاوی باکتری به مدت یک دقیقه ورتکس شد.
در این مرحله loading dye به آن افزوده شد.
نمونه های آماده شده بر روی ژل الکتروفورز 1% برده شد.
پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید، کلونی های حاوی پلاسمید نوترکیب در مقایسه با انواع بدون قطعه ژنی مورد نظر مشخص شد.
ه) تأیید کلونی های نوترکیب
برای تأیید ورود ژن مورد نظر در حامل بیانی pET28-a، پلاسمید نوترکیب در مقیاس کم از کلونی‌های تأیید شده و رشد یافته در محیط LB مایع حاوی کانامایسین با استفاده از کیتBioneer استخراج شد. برای بررسی کیفیت پلاسمید استخراج شده، 1 میکرو لیتر از نمونه روی ژل اگارز 1 درصد، الکتروفورز و غلظت آن با مقایسه با اندازه نمای DNA تخمین زده شد. سپس با پرایمر های کلونینگ واکنش PCR انجام شد و در نهایت نمونه پلاسمیدی برای تعیین توالی ارسال شد.
و) تعیین توالی نوکلئوتیدی
پس از دریافت نتیجه تعیین توالی، کیفیت توالی از روی ارتفاع امواج ثبتی حاصل بررسی شد. سپس توالی حاصل با استفاده از نرم افزار BLAST در پایگاه اینترنتی NCBI، جهت اطمینان از عدم ایجاد جهش و حذف ترادف نشانه ای در توالی کدکننده سراپپتیداز، مورد بررسی قرار گرفت.
ی) انتقال پلاسمید pET28-a (+) نوترکیب حاوی ژن کدکننده پروتئاز به درون باکتری BL-21 (برای بیان)
انتقال پلاسمید نوترکیب تخلیص شده به درون باکتری BL-21 به روش شیمیایی مذکور در بخش های قبل انجام شد.
3- 9بیان ژن سراپپتیداز و تعیین خلوص آن توسط SDS-PAGE
3-9-1القاء باکتری و بیان پروتئین های نوترکیب
شرایط بیان پروتئین نوترکیب: یک غلظت IPTG، در دمای C˚18 به مدت 9 ساعت و بعد از آن در دمای C˚27 به مدت 15 ساعت انکوباسیون به روش ذیل، در حجم 50 میلی لیتر مورد استفاده قرار گرفت:
یک کلونی از کلونی های مثبت درmL 25 محیط LB دارای کانامایسین، (در یک ارلن 50 میلی لیتری) تلقیح و به مدت یک شب در C˚37 انکوبه شد.
یک ارلن حاوی 250 میلی لیتر محیط LB دارای کانامایسین با غلظتmg/mL 50 تهیه شد. سپس با 2.5 میلی لیتر از محلول کشت مرحله قبل تلقیح شد.
ارلن برای رسیدن به 0.7-0.5OD600 = ، در دمای C˚37 و با شیک rpm 200 انکوبه شد.
پس از رسیدن به کدورت مطلوب، از ارلن به اندازه 1 میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری به عنوان نمونه قبل از القاء برداشته شد و در C°20- نگهداری شد.
به ارلن، 250 میکرولیتر IPTG (mM 100)، با غلظت نهایی 1 میلی مولار اضافه شد. طبق تنظیماتی که قبلا” انجام شده بود پس از 24 ساعت که بیان پروتئین به بیشترین حد خود می رسد، ارلن از انکوباتور خارج شد. به اندازه یک میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتریهای القاء شده به عنوان نمونه پس از القاء در داخل یک میکروتیوب برداشته و در فریزر C°20- نگهداری شد. محتویات هر ارلن خارج شده از انکوباتور در داخل فالکون ها تقسیم شده ، سانتریفیوژ شد (g 5000 و 20 دقیقه)، و سپس مایع رویی دور ریخته شد. کل توده باکتری باقیمانده با 4 میلی لیتر Tris-HCL (pH 8) شستشوداده شدو مجددا” با شرایط قبلی سانتریفیوژ و مایع رویی دور ریخته شد. پس از آن فالکون ها به دمای (C˚20-) انتقال یافتند.

3-9-2بررسی بیان پروتئین های نوترکیب با استفاده از روش الکتروفورز
به منظور بررسی بیان پروتئین های نوترکیب تحت شرایط اعمال شده، لوله های میکروتیوب حاوی نمونه های جمع آوری شدهاز فریزر C˚20- خا


دیدگاهتان را بنویسید