این پایان نامه را ضمن تشکر و سپاس بی کران و در کمال افتخار و امتنان تقدیم می نمایم به:

محضر ارزشمند روح پدر و مادر عزیزم به خاطر همه ی تلاشهای محبت آمیزی که در دوران مختلف زندگی ام انجام داده اند و با مهربانی چگونه زیستن را به من آموخته اند، و همواره نفس خیرشان و دعای روح پرورشان بدرقه ی راهم بود.

فهرست مطالب
عنوان
صفحه
چکیده
1
فصل اول: کلیات تحقیق
مقدمه
2
فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته
2ـ1ـ اشریشیا کلی یوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC)
4
2ـ2ـ فاکتور های بیماری زای تولید شده توسط UPEC
5
2ـ2ـ1ـ ادهسین ها و فاکتور های موثر در کلونیزاسیون
5
1_2_2_1_ پیلی یا فیمبریه (Fimbriae)
5
2_2_2_1_ فیمبریه نوع
6
3_2_2_1_ فیمبریه P
7
4_2_2_1_ فیمبریه S
8
5_2_2_1_ تاژک و تحرک
9
6_2_2_1_ Curli
10
7_2_2_1_ پیلی F جنسی
11
2ـ2ـ2ـ توکسین ها
11
1_2_2_2_ آلفا همولیزین
12
2_2_2_2_ فاکتور نکروز دهنده سیتوتوکسیک (CNF_1)
12
2ـ2ـ3ـ بقاء و فرار از سیستم ایمنی
12
1_2_2_3_ سیدروفور ها (آئروباکتین)
12
2_2_2_3_ کپسول پلی ساکاریدی
13
3_2_2_3_ تشکیل بیوفیلم
14
2ـ3ـ عفونت های مجاری ادراری( Urinary Tract Infection; UTI)
14
2ـ3ـ1ـ نقش پیلی در عفونت های مجاری ادراری
16
2ـ4ـ بیوفیلم ها
17
2ـ4ـ1ـ توسعه بیوفیلم
18
2ـ4ـ2ـ مقاومت آنتی بیوتیکی در بیوفیلم ها
20
2ـ4ـ3ـ بررسی ارتباط بین تشکیل بیوفیلم، فاکتورهای یوروویرولان و مقاومت ضد میکروبی
22
2ـ5ـ نقش آب گریزی (Hydrophobicity) در اتصال باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن
23
فصل سوم : مواد و روش ها
3ـ1ـ مواد و وسایل
24
3ـ1ـ1ـ محیط های کشت استفاده شده
24
3ـ1ـ2ـ مواد شیمیایی
24
3ـ1ـ3ـ کیت ها
24
3ـ1ـ4ـ دستگاه ها
24
3ـ2ـ جمع آوری نمونه ها
25
3ـ3ـ جداسازی و خالص سازی
25
3ـ4ـ مشاهده میکروسکوپی
25
3ـ5ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتریUPEC
26
3ـ6ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت
26
3ـ7ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با استفاده از هیدروکربن اکتان
26
3ـ8ـ استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت سینا ژن
28
3ـ9ـ تعیین کیفیت DNA با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز
28
3ـ10ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)
29
3_11_ الکتروفورز ژل آگارز
31
فصل چهارم: نتایج
4ـ1ـ آزمایشات تشخیصی برای تعیین اشریشیا کلی یوروپاتوژن (UPEC)
33
4ـ2ـ فراوانی باکتریهای بیماریزای جدا شده از ادرار
34
4ـ3ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC
34
4ـ4ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت
36
4ـ5ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با استفاده از هیدروکربن اکتان
38
4ـ6ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)
40

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5ـ1ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC
52
5ـ2ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت
44
5ـ3ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با استفاده از هیدروکربن اکتان
45
5ـ4ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)
46
نتیجه گیری
48
پیشنهادات
49
منابع و مآخذ
50
چکیده انگلیسی
57

فهرست شکل ها
عنوان
صفحه
شکل 1_1_ تفاوت Pili و Curli
11
شکل 1_2_ کپسول پلی ساکاریدی
13
شکل1_3_ مراحل توسعه یافتگی بیوفیلم
19
شکل4_1_ کلنی ها با جلای فلزی UPEC
34
شکل 4_2_ باسیل های گرم منفی UPEC
34
شکل 4_3_ محیط های افتراقی جهت بررسی E.coli جدا شده از ادرار
34
شکل 4_4_ هاله عدم رشد UPEC در حضور آنتی بیوتیک ها
36
شکل 4_5_ تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت با استفاده از روش اتصال به کریستال ویوله (CV)
37
شکل 4_6_ بررسی هیدروفوبیسیتی(قدرت اتصال) UPEC با استفاده از هیدروکربن اکتان
39
شکل 4_7_ نتایج الکتروفورز محصولPCR جهت شناساییژن هایpap (328 bp) و sfa (410 bp
41

فهرست جدول ها
عنوان
صفحه
جدول 1-1- ادهسین های اشریشیا کلی یوروپاتوژن (UPEC)
9
جدول 3-1- فرمول مورد نیاز برای تولید بیوفیلم
27
جدول 3-2- پرایمرهای استفاده شده در Multiplex PCR برای تعیین ژنهای ویرولان pap و sfa
30
جدول 3-3- دستور العمل انجام واکنش PCR تا حجم 25 میکرولیتر
30
جدول 3-4- مراحل برنامه تکثیر ژن های pap و sfa در دستگاه ترموسایکلر
31
جدول 4-1- نتایج تست های بیوشیمیایی جهت تایید باکتری های انتروباکتریاسه
33
جدول 4_2_ نتایج حاصل از تست تعیین مقاومت آنتی بیوتیکی با روش کربی _ بوئر
36
جدول 4_3_ نتایج تشکیل بیوفیلم
38
جدول 4_4_ نتایج حضور ژن های pap و sfa به روش Multiplex PCR در اشریشیا کلی جدا شده از عفونت ادراری
40
جدول 4_5_ نتایج حاصل از PCR برای 10 نمونه تشکیل دهنده بیوفیلم
40

فهرست نمودارها
عنوان
صفحه
نمودار 4_1_ درصد عوامل باکتریایی ایجاد کننده عفونت ادراری
35
نمودار4_2_ درصد مقاومت E.coli جدا شده از مبتلایان عفونت ادراری به آنتی بیوتیک ها
35
نمودار 4_3_ درصد تشکیل بیوفیلم UPEC
38
نمودار 4_4_ درصد هیدروفوبیسیتی UPEC به هیدروکربن اکتان
39

چکیده
عفونت دستگاه ادراری یکی از شایعترین عفونت های بیمارستانی است که از کلونیزه شدن اشرشیا کلی یوروپاتوژن در اپیتلیوم مخاطی میزبان ناشی می شود و به بافت میزبان آسیب می رساند. ساختارهای مختلف سطح سلولی در تشکیل بیوفیلم در اشرشیاکلی یوروپاتوژن دخیل هستند. از جمله فاکتورهای سطحی در اتصال باکتری و تشکیل بیوفیلم، پیلی P و S می باشد. هدف از این مطالعه تعیین میزان مقاومت آنتی بیوتیکی ، بررسی تشکیل بیوفیلم اشریشیا کلی یوروپاتوژن، سنجش قدرت اتصالی یا خاصیت هیدروفوبیسیتی آن و بررسی وجود ژن های فیمبریه ای pap وsfa و ارتباط آنها در تشکیل بیوفیلم بود.
در این تحقیق تعداد 100 نمونه از کشت باکتری بیماران مشکوک به عفونت دستگاه ادراری (UTI) جمع آوری گردید. با استفاده از تست های بیوشیمیایی متداول E.coli بودن 70 نمونه تایید گردید. مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن با استفاده از روش Kirby – Bauer مورد بررسی قرار گرفت. تشکیل بیوفیلم این باکتری با روش میکروتیترپلیت بررسی شد. به منظور بررسی اتصال باکتری و میزان هیدروفوبیسیتی ، روش هیدروکربن اکتان استفاده شد. پس از استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج، حضور ژن های pap و sfa به روش Multiplex PCR مورد بررسی گرفت.
از مجموع 100 نمونه مورد بررسی به کمک روش های بیوشیمیایی متداول 70 نمونه به عنوان اشریشیا کلی یوروپاتوژن شناسایی شدند. نتایج نشان دادن که این باکتری با هیدروفوبیسیتی 23% توانایی تشکیل بیوفیلم را دارد. از نظرمیزان تشکیل بیوفیلم 86% قدرت بسیار کم، 8/2 ? قدرت متوسط و 2/11? دارای قدرت بسیار بالا نشان دادند. همچنین بر اساس نتایج بدست آمده از آزمایش Multiplex PCR بر روی 10 نمونه ای که بالاترین قدرت تشکیل بیوفیلم را داشتند، 10نمونه (100?) واجد ژن pap، 7 نمونه (70?) واجد ژن sfa و 7 نمونه (70?) نیز به طور همزمان دارای ژن pap و sfa بودند.
نتایج این مطالعه نشان داد که ژن های pap و sfa شایعترین ژن های کد کننده پیلی در اشریشیا کلی های جدا شده از عفونت ادراری هستند که می توانند به اتصال این باکتری به بافت های میزبانی و تشکیل بیوفیلم های مقاوم به آنتی بیوتیک کمک کنند.
واژه های کلیدی: عفونتهای دستگاه ادراری، اشریشیا کلی یوروپاتوژن، تشکیل بیوفیلم، Multiplex PCR

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   تحقیق رایگان درمورد آموزش و پرورش، آموزش ضمن خدمت، اوقات فراغت جوانان

مقدمه:
اشریشیا کلی بیشترین گونه باسیل گرم منفی شایع در فلور مدفوعی است. این باکتری یک گونه فوق العاده متنوع است که توانایی کلونیزه شدن و پایداری در نیچ های بیشماری در میزبان های حیوانی، انسانی و محیط را دارد. بعضی از سویه های اشرشیا کلی می توانند از سویه های کامنسال خودشان متمایز شوند، بیماریزایی طبیعی بیشتر و توانایی ایجاد بیماریهای جدی تر در دستگاه گوارش، بافت ها و اندام های دیگر میزبان ایجاد کنند. این سویه های پاتوژن به طور گسترده به عنوان اشرشیا کلی اسهال زا یا اشرشیا کلی پاتوژن خارج روده ای Extra-intestinal Pathogenic E.coli;ExPEC ) ) طبقه بندی می شوند. از میان ExPEC ها، سویه های اشرشیاکلی یوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC)با بیماریزایی انسانی در ارتباط است. سویه های UPEC به عنوان فرصت طلب داخل سلولی عمل می کنند و با توجه به حساسیت و رفتار میزبان و توسط به کارگیری فاکتورهای ویرولان مختلف برای کلونیزه شدن در دستگاه ادراری برتری کسب می کنند. ( Johnson et al. 1998; Johnson. 2002; Marrs et al. 2005)
UPEC در مجاری ادراری می تواند در مثانه کلونیزه شود و ایجاد التهاب مثانه (Cystitis) کند و همچنین می تواند از طریق حالب به کلیه ها صعود کرده و باعث ایجاد پیلونفریت (Pyelonephritis) شود. مولکول و ساختارهای مختلف سطح سلولی در تشکیل بیوفیلم در اشرشیاکلی یوروپاتوژن دخیل هستند (Marrs et al,2005)
بیوفیلم ها مجموعه ای از سلول های میکروبی هستند که به طور برگشت ناپذیر به سطح وابسته اند و به وسیله شستشو ملایم از بین نمی روند. علاوه بر این، تمایز سلول های غیر متصل (Planctonic) به شکل بیوفیلم بالغ، تغییرات فنوتیپی را ایجاد می کند که دارای پیامد های عمده ای از قبیل افزایش مقاومت به عوامل ضد میکروبی و ازبین نرفتن توسط دفاع میزبان است. این تغییرات فنوتیپی باعث تغییر سلول های اشرشیا کلی از حالت غیر متصل (Planctonic) به حالت متصل می شود.(Hanna. 2003)
بیش از 50% همه عفونت های باکتریایی گزارش شده شامل تشکیل بیوفیلم اند. رشد بیوفیلم باکتریهای پاتوژن اغلب منجر به عفونت هایی می شود که تحمل به آنتی بیوتیک ها و پاسخ های ایمنی میزبان را افزایش می دهد ( Lane et al.2007).
عفونت های دستگاه ادراری ( Urinary Tract Infection ) یکی از شایعترین عفونت های بیمارستانی است که از کلونیزه شدن اشرشیا کلی یوروپاتوژن در اپیتلیوم مخاطی میزبان ناشی می شود و به بافت میزبان آسیب می رساند. UPEC مسئول ایجاد 80% همه عفونت های دستگاه ادراری علامت دار (UTI) و باکتریوریا بدون علامت(Asymptomatic Bacteriuria; ABU) است تقریبا بیشتر از 90% افراد جامعه به آن مبتلا می شوند (Ronald. 2002;Ulett et al. 2007).
تواناییUPEC برای متصل شدن به بافت های میزبان یکی از فاکتورهای برتری است که کلونیزاسیون UPEC را در دستگاه ادراری تسهیل می کند. چندین فاکتور سطحی در تشکیل بیوفیلم دخیل هستند مانند: تاژک، پیلی یا فیمبریه ، پروتئین های اتوترانسپورتر، کورلی، تولید اگزوپلی ساکارید و پیلی F جنسی ) (Soto et al. 2007.
واکنش های هیدروفوبیک نقشی را در اتصال میکروارگانیسم ها به طیف وسیعی از سطوح ایفا می کنند و تشکیل بیوفیلم را که منجر به اتصال باکتریایی می شود را تسهیل می کنند. ماهیت هیدروفوبیک خارجی ترین سطح باکتریایی به عنوان یک فاکتور در تقسیم بندی میکروارگانیسم ها، در اتصال باکتری ها به سطوح پلاستیکی، در اتصال باکتری ها به فاگوسیت ها و دیگر سلول های پستانداران و در رشد سلول ها بر روی لایه های نامحلول آبگریز مثل هیدروکربن ها، ذکر شده است. این یک عامل مهم در کمک به باکتری

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید